就在剛剛，復(fù)旦的科學(xué)家們成功復(fù)活了冷凍 18 個(gè)月的人類大腦，直接破了低溫技術(shù)領(lǐng)域紀(jì)錄，登上了 Cell 子刊。
網(wǎng)友們紛紛炸鍋：三體成真了？！這個(gè)項(xiàng)目，馬斯克看來(lái)是要投了。更有人為已經(jīng)在液氮罐中凍了幾年的冷凍人惋惜：是不是凍早了？
這項(xiàng)技術(shù)，是低溫技術(shù)領(lǐng)域的重大突破，為改進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究方法鋪平了道路。
本月，復(fù)旦大學(xué)邵志成博士團(tuán)隊(duì)的這篇工作，也正式登上了 Cell 子刊。
以前，腦組織是無(wú)法在冷凍和解凍過(guò)程中存活下來(lái)的。這個(gè)問(wèn)題，給醫(yī)學(xué)研究造成了巨大的障礙。
當(dāng)然，這依然阻擋不了有錢(qián)人的腳步 —— 他們前赴后繼地投入巨資，把自己的大腦乃至整個(gè)身體冷凍起來(lái)，以期在未來(lái)復(fù)活。
如今，他們的理想可以成真了！
對(duì)此，英國(guó)伯明翰大學(xué)的 Jo?o Pedro Magalh?es 教授表示，自己被震撼到了。
要知道，腦細(xì)胞是非常脆弱，對(duì)壓力極其敏感的。而團(tuán)隊(duì)采用的方法卻可以成功防止細(xì)胞死亡，甚至讓它們保留功能，這不得不說(shuō)是一項(xiàng)奇跡。
Magalh?es 教授大膽預(yù)言，我們現(xiàn)在完全可以想象這樣的場(chǎng)景 ——
幾十年或幾個(gè)世紀(jì)后，絕癥患者可以被冷凍保存，等待有治愈方法的那天。
宇航員可以被冷凍，醒來(lái)時(shí)就已經(jīng)被送到了其他星系。
至此，看來(lái)三體是要成真了，云天明的大腦不用靠三體人攔截，靠我們自己就能讓他復(fù)活。
這樣看來(lái)，馬斯克大概會(huì)非常喜歡這個(gè)研究，人體冷凍技術(shù)，或?qū)⒊蔀榭尚行跃薮蟮耐顿Y。
總的來(lái)說(shuō)，這個(gè)研究的亮點(diǎn)就是 ——
團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種全新的冷凍保存方法（MEDY）
MEDY 不會(huì)破壞神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能
MEDY 可用于保存各種腦類器官和人類腦組織
有趣的問(wèn)題來(lái)了 —— 大腦解凍后，腦中所有的信息 / 記憶也會(huì)被完好無(wú)損地保存嗎？
所以，我們究竟有沒(méi)有靈魂？
網(wǎng)友：請(qǐng)讓我在機(jī)器人體內(nèi)醒來(lái)
此消息一出，網(wǎng)友們立馬震驚了。
「人類的冰凍世時(shí)代要來(lái)了，我們將穿越浩瀚的虛空海洋，那里的每一顆星星，每一個(gè)未曾見(jiàn)過(guò)的角落，都將感受人類的觸摸?！?/p>
「太癲狂了，我們不僅能掃描人類大腦，還能把它們冷凍起來(lái)?！?/p>
已經(jīng)有志愿者表示，愿意參加人體試驗(yàn)了。
這位表示，已經(jīng)迫不及待想冷凍自己的大腦，然后在機(jī)器人體內(nèi)醒來(lái)了。
一覺(jué)睡過(guò)奇點(diǎn)，醒來(lái)就會(huì)身處一個(gè)嶄新的紀(jì)元。
「等我老了，把我冰凍，推送到一艘殖民船上，讓我的大腦在罐子里操作機(jī)器人?！?/p>
所以，如果當(dāng)初有人冷凍愛(ài)因斯坦的大腦，我們或許就能讓它復(fù)活了。
評(píng)論區(qū)被提到最多的科幻，就是三體和波比宇宙。
「現(xiàn)在我們只需要一個(gè) 1% 光速行進(jìn)的探針，就可以依靠自身動(dòng)力運(yùn)行數(shù)百萬(wàn)年，同時(shí)還要避免空間碎片。三體艦隊(duì)已經(jīng)走了 200 年了?！?/p>
當(dāng)然從現(xiàn)實(shí)層面講，還需要有一個(gè)巨大的鉛罩，來(lái)保護(hù)大腦免受宇宙輻射的影響。」
總之，這項(xiàng)研究實(shí)在太不可思議了，堪稱是打破了科幻和現(xiàn)實(shí)的壁壘。
討論甚至上升到了玄學(xué)。
言歸正傳，之前的那些低溫冷凍人，他們還好嗎？
有懂行的網(wǎng)友解釋說(shuō)，其實(shí)這些冷凍人也使用了類似的化學(xué)物質(zhì)。
凍整個(gè)人和只凍大腦最大的不同是，在人冷凍后，需要盡快讓化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入大腦的血液系統(tǒng)。冷凍必須逐漸進(jìn)行，以防止冰晶的形成，速度必須很快，因此任務(wù)很緊迫。如果沒(méi)有活躍的血液循環(huán)，大腦很快就會(huì)退化了。
而只凍大腦的時(shí)候，因?yàn)槭切颖?，因此不存在這些問(wèn)題。
從技術(shù)上講，這些人的身體并不是「冷凍」的，而是「玻璃化」的。一旦身體冷卻到零度以下，溶液非但不會(huì)結(jié)晶，反而會(huì)越來(lái)越厚。它就像一個(gè)玻璃塊，將所有細(xì)胞固定在原位，沒(méi)有任何內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，因此不會(huì)造成任何損害。
為了保證冰凍人們的未來(lái)，Alcor 公司成立了一個(gè)信托基金，作為一個(gè)獨(dú)立的實(shí)體來(lái)管理和保護(hù)冷凍患者的資金，以防幾百年后實(shí)施冰凍公司不在了。
冷凍人腦組織，現(xiàn)在可以無(wú)損復(fù)蘇
就在最近，著名科學(xué)雜志 New Scientist，還針對(duì)這項(xiàng)研究做了一篇專題報(bào)道。
復(fù)旦大學(xué)團(tuán)隊(duì)利用人類胚胎干細(xì)胞，在三周時(shí)間內(nèi)培育出了大腦類器官，這些自組織腦細(xì)胞的小簇，就可以發(fā)育成各種類型的腦細(xì)胞。
然后，研究人員將這些類器官浸入不同的化合物中，包括糖和防凍液，這樣就可以讓它們?cè)谝旱欣鋬鲋辽?24 小時(shí)。
樣本解凍后，他們?cè)诮酉聛?lái)的兩周內(nèi)，監(jiān)測(cè)它們的生長(zhǎng)和細(xì)胞死亡情況。
嘗試了各種不同化合物的組合之后，研究者發(fā)現(xiàn)了一種理想組合，可以讓組織解凍后死亡的細(xì)胞最少、生長(zhǎng)得更多。
這種組合，就是由甲基纖維素、乙二醇、DMSO 和 Y27632 組成的化學(xué)混合物，被研究者命名為「MEDY」。
有網(wǎng)友在 MEDY 的成分中發(fā)現(xiàn)了「華點(diǎn)」—— 如果喝了有其中 3 種成分的洗發(fā)水，會(huì)長(zhǎng)生不老嗎？
為何 MEDY 能保存脆弱的腦組織細(xì)胞呢？研究者認(rèn)為，這是因?yàn)?MEDY 干擾了一個(gè)通常會(huì)導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡的路徑。
隨后，團(tuán)隊(duì)對(duì) MEDY 進(jìn)行了一系列測(cè)試，實(shí)驗(yàn)對(duì)象包括從 28 天到超過(guò) 100 天的腦類器官。
這些器官在冷凍前，都會(huì)被放入 MEDY 中冷凍 48 小時(shí)，然后再解凍。
團(tuán)隊(duì)驚喜地發(fā)現(xiàn)，解凍后的類器官，在外觀、生長(zhǎng)和功能上與從未冷凍過(guò)的同齡類器官非常相似！即使是在 MEDY 中冷凍了 18 個(gè)月的類器官，也依然如此。
他們甚至創(chuàng)造了一項(xiàng)紀(jì)錄 —— 在解凍后，大腦類器官可以繼續(xù)生長(zhǎng)，存活長(zhǎng)達(dá) 150 天！
這種組合的有效性已經(jīng)得到了證明：研究者從一名 9 個(gè)月大、患有癲癇的女孩身上取出了 3 立方毫米的腦組織，腦組織在解凍后至少兩周內(nèi)，仍然保持著活躍狀態(tài)。
冷凍大腦怎樣保存
以下，就是冷凍和解凍大腦的具體步驟。
首先，在進(jìn)行冷凍保存之前，大腦類器官需要在含有 10μM Y27632 的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 1.5 小時(shí)。
隨后，我們需要將它轉(zhuǎn)移到冷凍保存溶液中，在室溫下靜置 1/6-5 小時(shí)。
這個(gè)靜置時(shí)間，取決于大腦類器官的直徑，它的直徑每增加 1 毫米，室溫預(yù)處理時(shí)間就需要延長(zhǎng) 20 分鐘。
之所以要進(jìn)行預(yù)處理，就是為了讓 Y27632 充分滲透到器官內(nèi)部，從而減少玻璃化現(xiàn)象，增加滲透壓。
預(yù)處理完成后，類器官就就可以放入存儲(chǔ)管中，在?80°C 的低溫下保存了。24 小時(shí)后，我們需要把它轉(zhuǎn)移到液氮中，進(jìn)行長(zhǎng)期保存。
冷凍完成了，該如何解凍呢？過(guò)程是這樣的。
首先，把類器官?gòu)囊旱腥〕?，盡快在 37°C 下解凍，這個(gè)速度越快越好。
然后，我們需要小心地將類器官轉(zhuǎn)移到含有 10μM Y27632 的 W4 培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天，然后繼續(xù)在 37°C 下培養(yǎng)。
兩天后，每天都要更換一次培養(yǎng)基。
從第三天起，就要開(kāi)始使用不含 Y27632 的 W4 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)兩天。
最后，將解凍后的類器官用 Matrigel 包裹起來(lái)，并繼續(xù)培養(yǎng)。
掌握了以上步驟，我們就可以順利冷凍自己的大腦了不是。
論文結(jié)果
高效保存皮質(zhì)類器官
為了解決 3D 腦類器官長(zhǎng)期可靠存儲(chǔ)的挑戰(zhàn)，團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出了一種新的冷凍保存方法，包括對(duì)冷凍介質(zhì)成分和冷凍解凍過(guò)程的精確控制（圖 1A）。
為了進(jìn)一步提高冷凍保存的效率，團(tuán)隊(duì)測(cè)試了候選試劑與 ROCK 抑制劑 Y27632 的不同組合，形成了新的冷凍介質(zhì)（CM1–CM4）。
綜合來(lái)看，CM1（1% 甲基纖維素 + 10% 乙二醇 + 10% DMSO + 10μM Y27632）是腦類器官的最佳冷凍介質(zhì) —— 即 MEDY。
維持功能性細(xì)胞結(jié)構(gòu)
腦室區(qū)（VZ）的結(jié)構(gòu)和多個(gè)皮質(zhì)層在維持腦類器官功能方面起著重要作用，能否在冷凍保存后保留這種功能結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。
團(tuán)隊(duì)使用 MEDY 冷凍保存了 28 天的皮質(zhì)類器官，并在解凍后繼續(xù)培養(yǎng) 3 周，然后進(jìn)行皮質(zhì)層標(biāo)記物的免疫染色（圖 2A 和 2B）。
在第 50 天，解凍后的類器官中 Sox2 + 和 Pax6 + 的 VZ 樣結(jié)構(gòu)完全保留（圖 2C 和 2D）。具有正常形態(tài)和神經(jīng)突生長(zhǎng)的 MAP2 + 和 Tuj-1 + 神經(jīng)元均勻分布在 VZ 樣區(qū)域的外層附近（圖 2C 和 2D）。
不僅如此，團(tuán)隊(duì)還檢查了冷凍保存 1 年半后復(fù)蘇的類器官。免疫染色顯示，祖細(xì)胞和神經(jīng)元得到了良好的維持，大多數(shù)祖細(xì)胞在解凍后仍在增殖，這與正常組相似。
綜上所述，皮質(zhì)類器官的功能性細(xì)胞結(jié)構(gòu)在 MEDY 冷凍保存過(guò)程中得到了很好的保留。
細(xì)胞多樣性和細(xì)胞群
為了探討 MEDY 冷凍保存是否會(huì)影響基因表達(dá)，團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了整體 RNA 測(cè)序，檢查了正常和 MEDY 冷凍保存類器官的基因表達(dá)譜。
結(jié)果顯示，NPC 標(biāo)記物的表達(dá)沒(méi)有明顯差異（圖 3A 和 3B）。與神經(jīng)元相關(guān)的基因，包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、多層皮質(zhì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，具有相似的轉(zhuǎn)錄譜，表明冷凍保存過(guò)程沒(méi)有引起基因表達(dá)的變化（圖 3A–3E）。
為了研究 MEDY 冷凍保存類器官的細(xì)胞多樣性和細(xì)胞群，團(tuán)隊(duì)還進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測(cè)序。
結(jié)果顯示，正常和解凍后的皮質(zhì)類器官都包含主要的神經(jīng)細(xì)胞群體，包括多層皮質(zhì)神經(jīng)元、NPC 和膠質(zhì)細(xì)胞（圖 3F 和 3G）。其中，NPC 的數(shù)量沒(méi)有減少，這表明 MEDY 冷凍保存沒(méi)有抑制正常類器官的神經(jīng)發(fā)育過(guò)程（圖 3H 和 3I）。
功能活動(dòng)可得到維持
為了驗(yàn)證解凍后的類器官是否仍具有功能性神經(jīng)活動(dòng)，團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了鈣成像實(shí)驗(yàn)。
經(jīng)過(guò)約 20 秒的刺激后，可以在 MEDY 冷凍保存的類器官中檢測(cè)到強(qiáng)烈的鈣活動(dòng)（圖 4A–4C）。這些結(jié)果表明，冷凍保存后谷氨酸能突觸連接仍然得以維持。
為了進(jìn)一步確認(rèn)類器官的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理特性，團(tuán)隊(duì)使用微電極陣列（MEA）檢測(cè)了第 114 天神經(jīng)元活動(dòng)的同步性（圖 4D）。
在正常和解凍后的類器官中都能檢測(cè)到同步活動(dòng)，表明網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)得到了良好的保留（圖 4E–4G）。類器官的尖峰頻率在冷凍保存過(guò)程中基本未受影響（圖 4H），120 秒內(nèi)激活的電極總數(shù)沒(méi)有差異（圖 4I）。網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)的數(shù)量也沒(méi)有顯著減少，這表明類器官中神經(jīng)元功能連接的復(fù)雜性（圖 4J）。
總的來(lái)說(shuō)，MEDY 冷凍保存基本上保護(hù)了冷凍保存類器官的功能連接。
多腦區(qū)特異性類器官
為了進(jìn)一步驗(yàn)證 MEDY 冷凍保存是否可以用于維持各種腦區(qū)特異性類器官，團(tuán)隊(duì)分別誘導(dǎo)了 GABA 類器官、SP 類器官和 OVB 類器官（圖 5G）。
結(jié)果顯示，每個(gè)類器官的軸突在第 6 天左右開(kāi)始生長(zhǎng)，且在 MEDY 冷凍保存后幾乎沒(méi)有細(xì)胞碎片從類器官中釋放出來(lái)。
此外，解凍后的 GABA 類器官中，GAD67 + 抑制性神經(jīng)元得到了良好的保護(hù)，NKX2.1 + 抑制性祖細(xì)胞也處在相似的水平。
在 SP 類器官中，Hoxc9 + 細(xì)胞顯示出與人類胸椎 SP 相同的結(jié)構(gòu)特征，并在兩組中具有相似的豐度（圖 5I 和 5K）。NKX6.1 + 腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞和 Pax6 + 細(xì)胞同樣聚集，且豐度相似（圖 5H 和 5J）。
在 OVB 類器官中，Pax6 + 和 RX + 視泡樣結(jié)構(gòu)在冷凍保存過(guò)程中也得到了保護(hù)，與正常相似。
總的來(lái)說(shuō)，各種腦區(qū)特異性類器官的細(xì)胞多樣性和結(jié)構(gòu)得到了良好的保存，這表明 MEDY 冷凍保存技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于不同的神經(jīng)類器官。
來(lái)自患者的腦組織
為了擴(kuò)展 MEDY 冷凍保存技術(shù)在臨床上的潛在應(yīng)用，團(tuán)隊(duì)基于癲癇患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）制備了腦類器官（圖 6A）。
解凍后第 7 天到第 14 天，軸突生長(zhǎng)強(qiáng)勁，超過(guò) 200μm（圖 6B）。此外，免疫染色顯示，神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞群體沒(méi)有異常（圖 6C–6H）。這些結(jié)果表明，MEDY 冷凍保存可用于存儲(chǔ)來(lái)自患者的神經(jīng)類器官。
據(jù)此可以推測(cè)，MEDY 也能用于冷凍保存具有病理特征的新鮮患者腦組織，這對(duì)基礎(chǔ)研究以闡明腦疾病的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要（圖 6I）。
結(jié)果顯示，大小約為 3mm 的腦組織在 MEDY 冷凍保存后存活，因?yàn)榇罅炕罴?xì)胞可以在第 14 天從組織中遷移出來(lái)（圖 6J）。此外，大多數(shù)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞得到了良好的保存（圖 6K 和 6L）。
總的來(lái)說(shuō)，通過(guò) MEDY 可以保存來(lái)自癲癇患者的腦類器官和具有病理特征的活腦組織。
對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用
為了了解 MEDY 冷凍保存對(duì)腦類器官的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，團(tuán)隊(duì)對(duì)使用 MEDY 冷凍保存后的皮質(zhì)類器官進(jìn)行了整體 RNA 測(cè)序。
結(jié)果顯示，與未冷凍保存的類器官相比，MEDY 在四個(gè)基因（APOL1、IL11、ULBP1、ULBP2）上的表達(dá)水平相似（圖 7G），進(jìn)一步表明 MEDY 可以通過(guò)在冷凍保存或解凍過(guò)程中抑制這些基因的表達(dá)來(lái)防止類器官細(xì)胞的凋亡。
這些結(jié)果表明，MEDY 冷凍保存可以通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑來(lái)維持類器官的存活和神經(jīng)功能（圖 7H）。
作者介紹
邵志成，博士畢業(yè)于上海交通大學(xué)，先后在中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，阿拉巴馬大學(xué)以及哈佛大學(xué)進(jìn)行博士后研究。
2020 年 2 月加入復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院，博士生導(dǎo)師，上海市東方學(xué)者特聘教授，主要從事體細(xì)胞重編程，中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生，以及精神疾病發(fā)病機(jī)制研究。
課題組利用特定疾病類型的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，結(jié)合 3D 類腦器官 (Organoid) 等技術(shù)，研究精神疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找藥物靶點(diǎn)和建立藥物篩選平臺(tái)。
同時(shí)利用轉(zhuǎn)分化技術(shù)，結(jié)合材料科學(xué)制備類器官芯片，探究 3D-organoid 移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織再生的新策略。
目前，以第一作者和通訊作者在國(guó)內(nèi)外重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表多篇論文，其中包括 Nature Biomedical Engineering、Nature Neuroscience、Biomaterials、Nature Communications、Cell Reports 等。
參考資料：
https://www.newscientist.com/article/2431153-frozen-human-brain-tissue-can-now-be-revived-without-damage/
https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(24)00121-8
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